流式實驗應用中，除了常見的表面抗原染色，還會進行胞內因子檢測，比如：常見的細胞因子：IFN、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF；核內轉錄因子：FOXP3、GATA3、STAT5；胞內信號通路相關蛋白：MAPK家族 (AKT、P38、JNK、ERK) 等。胞內染色步驟相對復雜，涉及的變異因素多，很容易出現結果不穩定、較難重復等問題。
一般情況下，靜息狀態的T、B細胞不產生或極低產生細胞因子，多數細胞因子必須在T細胞激活后才能分泌產生，所以必須采用體外激活來刺激細胞因子的表達。流式胞內染色中*常用的活化方法就是使用一定濃度的廣泛性刺激劑：PMA (佛波酯) 和lonomycin (離子霉素)，刺激細胞4-6 h (可優化)。
PMA和lonomycin刺激細胞活化的機制：在細胞內，Protein kinase C(PKC) 的激活，可以引起下游眾多蛋白激酶的磷酸化，形成級聯反應，導致多種蛋白的表達引起細胞的活化。PKC可以在DAG (二酯酰甘油) 和Calcium (Ca2+) 的共同作用下被激活，PMA是一種DAG的模擬物，lonomycin 是Ca2+的轉運劑，可將細胞器內的Ca2+ 轉運到胞漿，所以PMA和lonomycin的共同作用可以激活PKC，從而引起一系列的下游反應。
刺激后的細胞不能直接進行流式檢測，細胞因子會分泌到胞外影響實驗結果，還需要加入阻斷劑，將細胞因子阻斷在胞內，有助于細胞因子的聚集使胞內染色信號增強，提高檢出率，所以這一步至關重要。常用的阻斷劑有兩種：1. Monensin (莫能霉素)；2. Brefeldin A (BFA，布雷非德菌素a)。
Monensin是一種離子載體(ionophore)，可選擇性結合單價陽離子如：Li+、Na+、K+、Rb+、Ag+和Tl+，并把這些陽離子轉運到細胞膜內，破壞跨膜離子梯度；BFA是一種真菌代謝物，可以干擾囊泡自粗面內質網至高爾基體的轉運。這兩種阻斷劑的區別：Monensin的阻斷作用在高爾基體轉運到胞外，BFA的阻斷作用在內質網轉運到高爾基體。
